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反相色谱介绍

发布时间:2014-12-16浏览:1568次

   反相液相色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚,是液相色谱分离模式中使用为广泛的一种,对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析,反相液相色谱正受到越来越多的关.反相色语法是以表面非极性载体为固定相,面以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式.反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团,基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离.在生物大分子分离中,多采用离子强度较低的酸件水溶液,添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶有机溶剂作流动相.普通的反相色谱固定相和孔径大于300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍,聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用。
  反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定,保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大,对于非极性化合物通常遵循以下规则:(弱)非键合硅胶 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(强).溶质保留值与固定相表面积成正比,普通载体(80Å)的表面积约为250m/g,而300Å孔径载体的比表面积约为60m/g。当其他条件相同时,溶质在300Å孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80Å孔径色谱柱上保留值的1/4(60:250),小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱.样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整,溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度.在反相色谱中,采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值.固定相的不同也可以导致选择性发生变化,氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异,一般应优先考虑C8、C18柱,然后是氰基柱,再次是苯基柱。

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